閱讀次數(shù)：985 發(fā)布時(shí)間：2015/8/21 15:04:10
中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)步驟說明
１ 原理
中性粒細(xì)胞中的堿性磷酸酶（簡(jiǎn)稱堿酶）在一定條件下能使β－甘油磷酸鈉水解釋出無機(jī)磷，后者與鉬酸試劑結(jié)合成磷鉬酸復(fù)合物，再以氨基萘酚磺酸還原為鉬藍(lán)而呈現(xiàn)藍(lán)色，用光電比色法求得所釋放的無機(jī)磷含量，表示酶的活性。
２ 試劑
�。幔暇厶牵悍肿恿浚玻叭f，用生理鹽水配制成２％溶液，在冰箱中可保存一個(gè)月。
ｂ．β－甘油磷酸鈉溶液（０．０２６Ｍ）：稱取β－甘油磷酸鈉溶于碳酸—重碳酸鹽緩沖溶液，將ｐＨ調(diào)至９．９，液面蓋一層石油醚，在冰箱內(nèi)保存。
�。悖妓幔靥妓猁}緩沖液：
�。烈骸》Q取無水碳酸鈉２．１２ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ無水碳酸鈉溶液。
�。乱骸》Q取碳酸氫鈉１．６８ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ碳酸氫鈉溶液。
�。烈海保埃埃恚炫cＢ液１００ｍｌ混合，加重蒸餾水６００ｍｌ，ｐＨ為９．９。
�。洌硭兀河蒙睇}水配成２％溶液。
�。澹然V溶液（０．０５Ｍ）：用重蒸餾水配成。
�。妫纫宜崛芤海河弥卣麴s水配成５０％及５％二種濃度。
�。纾f酸銨溶液：稱取鉬酸銨１２．５０ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，加１０Ｍ硫酸１５０ｍｌ，再加重蒸餾水到５００ｍｌ。
�。瑁埃玻担グ被练踊撬崛芤海悍Q取氨基萘酚磺酸０．０６２５ｇ、亞硫酸氫鈉１．３３ｇ、亞硫酸鈉０．２５ｇ，于研缽中磨成細(xì)粉，加重蒸餾水到２５ｍｌ，過濾后保存于冰箱內(nèi)。用時(shí)稀釋一倍。
�。椋畼�(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液（每毫升含無機(jī)磷１ｍｇ）： 稱取干燥恒重的分析純磷酸二氫鉀２．１９７１ｇ置于容量瓶中，加重蒸餾水至５００ｍｌ，加氯仿２滴，在冰箱內(nèi)保存。
ｊ．肝素：用生理鹽水配成１％溶液。
３實(shí)驗(yàn)方法
�。常薄“准�(xì)胞分離
自耳垂或手指取血０．１５ｍｌ，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的含１滴肝素和０．３０ｍｌ葡聚糖溶液的微量試管中，用手振搖混勻，靜置１０分鐘。待紅細(xì)胞沉降界面清晰時(shí)，小心吸出上層懸浮液，置于小離心管中，加入２倍生理鹽水，搖勻后離心（２５００轉(zhuǎn)／分鐘）８分鐘。取出上清液棄去，保留沉淀。再向有沉淀的離心管加生理鹽水２ｍｌ，混勻，再離心８分鐘。重復(fù)２次，棄去上清液，管中留下液體約０．１５ｍｌ，與沉淀混勻，即為白細(xì)胞懸浮液，作白細(xì)胞計(jì)數(shù)２～４次，取其
平均值。 此白細(xì)胞懸浮液供酶活性測(cè)定之用。如不能立即測(cè)定，需放置冰箱內(nèi)，
但必須在當(dāng)天測(cè)定。
３．２ 白細(xì)胞堿酶活性的測(cè)定
取一小試管，加入β—甘油磷酸鈉 ０．８５ｍｌ ，皂素 ０．０５ｍｌ，
氯化鎂０．０２ｍｌ，于３７℃水浴中預(yù)熱５分鐘，然后準(zhǔn)確加入白細(xì)胞懸浮液０．０５ｍｌ，混勻，繼續(xù)保溫６０分鐘，到時(shí)立即加入５０％三氯乙酸０．１５
�。恚焓狗磻�(yīng)終止，以２５００轉(zhuǎn)／分離心１０分鐘，除去沉淀。
每個(gè)樣品都需作對(duì)照管測(cè)定，對(duì)照管所加內(nèi)容物同上，僅白細(xì)胞懸浮液須在保溫后加５０％三氯乙酸后加入。
分別取樣品和對(duì)照管上清液０．８０ｍｌ，各加入鉬酸銨試劑０．１５ｍｌ，氨基萘酚磺酸溶液０．１０ｍｌ，重蒸餾水１．４５ｍｌ，顯色２０分鐘，用分光光度計(jì)測(cè)定光密度（ 所用波長(zhǎng)為６６０ｎｍ、比色杯厚１０ｍｍ ），分別讀取樣品管、對(duì)照管的光密度。每管重復(fù)讀數(shù)兩次，取其平均值。
�。常场×讟�(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
取標(biāo)準(zhǔn)磷儲(chǔ)備液，用５％三氯乙酸稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液，濃度分別為：１．０，３．０，５．０，７．５，１０．０ｍｇ／１。然后取試管５支，分別在每一試管加入１．０ｍｌ上述標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液之一種，以及鉬酸銨０．１５
�。恚欤被练踊撬幔埃保埃恚�，重蒸餾水１．２５ｍｌ，按上法顯色，讀取
各管的光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
３．４ 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
在取血分離白細(xì)胞的同時(shí)，�。钡窝魍科�，瑞氏染色，按常規(guī)分類計(jì)數(shù)嗜中性白細(xì)胞的百分比。
３．５ 計(jì)算方法
白細(xì)胞堿酶活性用單位表示，以每十億個(gè)中性白細(xì)胞在３７℃條件下，１小時(shí)釋放出１ｍｇ無機(jī)磷為一個(gè)單位。計(jì)算公式如下：
酶活性（單位）＝｛〔ｐｉ（樣）—ｐｉ（對(duì)）〕×１００００×１．４０｝÷（Ｗ·Ｖ·Ｎ）
式中：ｐｉ（樣）——樣品管無機(jī)磷，μｇ；
�。穑椋▽�(duì)）——對(duì)照管無機(jī)磷，μｇ；
Ｗ——白細(xì)胞懸液的白細(xì)胞數(shù)，個(gè)／立方毫米；
�。�——酶反應(yīng)所加入白細(xì)胞懸液的量，ｍｌ；
�。�——嗜中性白細(xì)胞，％。
注：為減少操作誤差，提高結(jié)果準(zhǔn)確性，也可自靜脈采血１．５ｍｌ，按常量法進(jìn)行操作。詳見《衛(wèi)生研究》５（６）：４８１，１９７６。
４ 注意事項(xiàng)
�。幔准�(xì)胞懸液必須充分搖勻，不應(yīng)有聚集的細(xì)胞。白細(xì)胞計(jì)數(shù)要準(zhǔn)確，一般應(yīng)計(jì)數(shù)２～４次，取平均值。
�。猓畨A酶活性測(cè)定中，白細(xì)胞懸液的加入量要準(zhǔn)確，吸取時(shí)注意搖勻。
ｃ．堿酶反應(yīng)保溫時(shí)間（６０分鐘）要準(zhǔn)確。
ｄ．顯色反應(yīng)不應(yīng)出現(xiàn)沉淀。
ｅ．用分光光度計(jì)讀數(shù)時(shí)，樣品管與對(duì)照管都應(yīng)重復(fù)兩次。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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