免疫熒光技術(shù)有兩種檢測方法：用熒光標(biāo)記抗體示蹤或檢測相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光標(biāo)記抗原示蹤或檢測相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。（熒光抗體方法較常用）
1.在開始實驗研究前，有哪些因素需要考慮？
（1）根據(jù)抗原選擇合適的抗體，確認(rèn)抗原可以識別哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置。
（2）確認(rèn)目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)。
（3）根據(jù)所要研究的目標(biāo)蛋白來確定合適的樣本類型（石蠟切片、冰凍切片還是細(xì)胞制備物等）。
（4）選擇抗體時需要考慮該抗體的物種交叉反應(yīng)。
（5）關(guān)于蛋白，需要考慮它的組織定位和細(xì)胞定位，以及染色時是否應(yīng)該有信號。
（6）選擇合適的固定方法及抗原修復(fù)方法。
（7）抗體的工作濃度或稀釋比例，以及抗體的物種來源也是需要考慮的重要因素。
2.免疫組化實驗里為什么要對樣品進(jìn)行處理？
樣品處理是為了調(diào)控樣本中蛋白的表達(dá)水平，如果是細(xì)胞實驗，就需要使用適當(dāng)?shù)囊种苿┗蚣せ顒﹣砩险{(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)；如果是體內(nèi)實驗，就需要考慮更多的因素，因為實驗對象是活的實驗動物，在選擇抑制劑或激活劑、激動劑或拮抗劑時，應(yīng)盡量避免由于非特異性結(jié)合其它蛋白所導(dǎo)致的非特異性效應(yīng)。對于某些特殊試驗樣品，比如腦，我們需要確保細(xì)胞的滲透性，讓化合物能真正進(jìn)入細(xì)胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學(xué)品能夠溶于合適的溶劑，還有確定適合的給藥途徑（注射或口服）。
3.請問如何根據(jù)具體的實驗對象來選擇不同的樣本形式呢？
對于細(xì)胞制備物，它們常見的形式是涂片或培養(yǎng)的細(xì)胞系。對于組織樣本，常用的是石蠟包埋的組織切片，福爾馬林固定。是因為它們能夠保持組織形態(tài)與蛋白抗原性之間的zui佳平衡。石蠟包埋的組織切片很穩(wěn)定，并且易于使用。但它的不足之處是很耗時（需要對切片進(jìn)行脫蠟處理和抗原修復(fù)）。一般來說，石蠟切片適用于4微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米，抗體可能會被困住，導(dǎo)致假陽性染色，這是我們需要避免的。
另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片，這對于不能經(jīng)受醛固定處理和石蠟處理的抗原來說非常理想，因此這些抗原將呈現(xiàn)出更天然的狀態(tài)，但冰凍切片的缺點(diǎn)是組織形態(tài)可能不佳。冷凍切片通常僅適用于厚度為4-10微米的薄切片，超過這個厚度的切片可能會困住抗原，導(dǎo)致假陽性染色結(jié)果。如果要研究的組織類型無法做成這種厚度的薄切片，可以考慮采用漂片。該技術(shù)一般用于腦組織和脊髓，在發(fā)育研究中，這是一項非常有用的技術(shù)，可用于厚度達(dá) 40 微米的更大切片。缺點(diǎn)是操作起來更加不便，整個過程中組織樣品都處于自由漂浮狀態(tài)，之后還必須將它們固定在載玻片上進(jìn)行觀察，操作有一定的難度；另一個缺點(diǎn)就是非常耗時。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
