閱讀次數(shù)：2891 發(fā)布時間：2016/3/16 10:17:25
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制要點及結(jié)果處理方法
許多試劑檢測都涉及到標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題，標(biāo)準(zhǔn)曲線做的好與壞會直接影響到實驗的結(jié)果，甚至是關(guān)系到實驗的成敗，那么究竟如何繪制或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線呢？
首先我們需要了解下標(biāo)準(zhǔn)曲線中的問題：
標(biāo)準(zhǔn)曲線不正確
標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉溶解體積錯誤
確保凍干粉用正確的體積溶解，溶解體積在說明書或小瓶上標(biāo)有。
溶解時間太短
確保溶解時間足夠長讓凍干粉充分溶解。
濃縮標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤
確保濃縮標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)說明書要求正確稀釋。
材料/預(yù)稀釋液保存有誤
標(biāo)準(zhǔn)液和預(yù)稀釋液的保存按照說明書要求。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時不正確混勻
濃縮標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋并正確混勻。
檢測波長錯誤
確保檢測時光度計的波長是正確的。
使用其他試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品
只能用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品做實驗，不能用其他試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品替代。
其次做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意
1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。
4、檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品時，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。
5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個點，但至少要保證有5個點。
6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎�，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對于有些實驗，至少要0.99甚至是0.999.
1. ELISA實驗中樣品都要做復(fù)孔或三孔，然后計算每個濃度標(biāo)準(zhǔn)品的平均OD值，復(fù)孔的變異系數(shù)應(yīng)該小于20%。
2. 平均OD值減去空白孔的OD值。
3. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
以減去本底后的OD值為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為Y軸，利用作圖軟件得出一個合適的計算方法。建議使用合適的軟件來作圖，比如CurveExpert 1.4。這款軟件能夠給出很多種方法（比如直線、半對數(shù)、對數(shù)、四參數(shù)方程等）并從中選擇一條最合適的方程。要想檢驗?zāi)硹l曲線是否與表中數(shù)據(jù)吻合，可以將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為未知數(shù)，將對應(yīng)的OD值帶入該方程，計算出標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，得到的結(jié)果應(yīng)該與實際濃度很接近（+/-10%）。選擇擬合度最高的那條曲線。
以下是CurveExpert1.4的使用過程：
① 將OD值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度數(shù)據(jù)復(fù)制粘貼到表格中
② 生成和選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線
③ 通過曲線計算樣品濃度
輸入OD值，點擊“計算”按鈕，得到樣品的準(zhǔn)確濃度。
或者得到相關(guān)方程，通過excel來計算濃度。
如果需要導(dǎo)出方程，可點擊“復(fù)制”，粘貼至excel中。
④ 對于OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外的情況
如果樣品的OD值超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，在實驗前應(yīng)該先將樣品稀釋從而得到準(zhǔn)確的濃度。樣品的最終度應(yīng)該是計算出的濃度乘以稀釋倍數(shù)。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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