閱讀次數(shù)：905 發(fā)布時間：2015/10/14 10:31:33
檢測血小板活化因子(PAF)，現(xiàn)用得較多的有生物法和物理學方法。因生物法缺乏特異性，物理學方法價格昂貴，操作繁瑣，90年代以來，國外開始用放射免疫法檢測PAF。我們試用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法檢測PAF，報告如下。
一、材料和方法
1.材料：腎小球腎炎病人血漿標本各20份。PAF標準品、雞卵清蛋白為Sigma產(chǎn)品，辣根過氧化物酶(HRP，上海恒遠生物工程公司)，硼氫化鈉等為國產(chǎn)分析純試劑。DG-3022A酶標儀。96孔酶標板。
2.PAF抗體和酶標PAF抗體制備和鑒定：(1)參照文獻改良制備出PAF免疫原，皮下和足底加淋巴結(jié)注射免疫新西蘭白兔，免疫5次。用飽和硫酸胺沉淀法與DEAE-23層析柱法提取免疫血清中的PAF抗體，聚乙二醇濃縮后分裝凍存。(2)用過碘酸鈉氧化結(jié)合法制備HRP標記的PAF抗體，SephadeXG100過濾純化，測酶標PAF抗體A280nm和A403nm值。(3)雙向瓊脂擴散試驗和ELISA法測PAF抗體效價及鑒定其特異性，并鑒定酶標PAF抗體中酶與抗體的活性。
3.包被抗體稀釋度與酶標抗體工作濃度：(1)按對照法，抗體(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3 200、1∶6 400)包被，雞卵清蛋白封閉，PAF標準品(100 μg/ml)，酶標抗體(1∶800)并加底物，測A490nm值。(2)步驟同上，改包被抗體為1∶1600，酶標抗體按(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3200、1∶6 400)濃度稀釋。
4.標準曲線的建立：用純化的抗體(1∶1 600)包被，雞卵清蛋白封閉，用PAF標準品(0.5、1、2、5、10、20、40、80、160 ng/ml)、酶標抗體(1∶1 600)，加底物測A490nm值。
5.血漿樣品分析：(1)提取標本中的脂質(zhì)，加入二乙醚中溶解，離心取上清液待測。(2)ELISA法檢測：步驟同4，只是將PAF標準品換成處理后的標本(每一標本做6孔)。(3)生物活性檢測法：先制出PAF標準品所致的血小板聚集程度的標準曲線。提取的待檢標本經(jīng)薄層層析后血小板自動平衡儀檢測，根據(jù)標準曲線計算出PAF的含量。
二、結(jié)果
1.雙向瓊脂擴散試驗測得免疫血清最高效價為1∶32，免疫血清與PAF之間出現(xiàn)一條明顯的沉淀線，與溶PAF、膽固醇等之間無沉淀線；酶標PAF抗體與PAF之間產(chǎn)生一條沉淀線，沉淀線用生理鹽水漂洗后，加OPD底物產(chǎn)生顏色反應。ELISA測得免疫血清最高效價為1∶10240。特異性試驗：PAF抗原孔P/N≥2.1(5.94)，溶PAF、膽固醇等孔P/N均小于2.1。ELISA法顯示酶和抗體都有生物學活性。
2.酶標抗體克分子比值：酶(g/L)×4/IgG(g/L)=1.2。
3.包被抗體和酶標抗體稀釋度均為1∶1 600時，A490nm的值接近1.0，為較好的工作濃度。ELISA夾心法標準曲線結(jié)果表明，PAF在2～80 ng/ml范圍內(nèi)曲線線性較為良好。
4.正常人血漿中的PAF值為(4.6±2.7) μg/L(ELISA法)，(3.5±2.4) μg/L(生物法)，病人血漿中的PAF值為(12.7±4.4)μg/L(ELISA法)，(9.8±3.6) μg/L(生物法)。正常人與病人PAF值采用均數(shù)t檢驗，P＜0.01。
5.20份標本每份以6孔測定，平均批內(nèi)誤差0.048，在3次不同檢測中，平均批間誤差0.110。
三、討論
現(xiàn)無公認的可靠、快速、靈敏、實用的檢測PAF方法，主要是因為PAF在體內(nèi)含量低，不易測出，且半衰期短，不易捕捉。我們先制備出抗PAF免疫血清，成功地提取PAF抗體并制備出HRP標記PAF抗體，通過雙向瓊膽擴散試驗和ELISA鑒定，PAF抗體有較好效價和特異性，酶標PAF抗體中，酶和抗體都有生物學活性。在探討ELISA法時，因考慮到ELISA間接法中，PAF作為一種脂類，包被較為困難，且PAF標準品昂貴，此法PAF用量較多，ELISA競爭法及ABC-ELISA法較為繁瑣，因此我們采用了ELISA夾心法。
為驗證所建立方法的可靠性，我們對20名正常人和20例腎小球腎炎病人的血漿標本進行了PAF測定，同時用生物法檢測作對照，兩種方法均測出正常人和病人血中的PAF，并且二者呈較好的平行相關。對于腎小球腎炎病人血液中PAF升高已基本得到公認，本試驗建立的ELISA法所測得同一標本的值較生物法高，可能與標本中的PAF沒有經(jīng)過進一步純化等有關。
PAF是一種極為重要的炎癥介質(zhì)，在諸多的生理和病理情況下發(fā)揮激素樣的生物學作用。我們檢測PAF所用的ELISA夾心法較為簡便，特異性、靈敏度、重復性均較好，比較實用可靠，在一定的范圍內(nèi)能反映PAF的含量，值得進一步探索。
原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司
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