閱讀次數(shù)：1027 發(fā)布時間：2015/5/13 10:09:12
ELISA檢測的目的是為實驗提供準(zhǔn)確可靠的定量分析實驗依據(jù)。為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性，在實驗過程中必須堅持全面質(zhì)量控制和全過程質(zhì)量控制。在收集標(biāo)本前都必須有一個完整的計劃。
注意事項：
◆ 每個標(biāo)本量收集體積＝10ul×檢測種類，如要做復(fù)孔，標(biāo)本量收集體積＝10ul×檢測 種類×2。
◆ 對于作某一個具體指標(biāo)來說，最好先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測定，得出對實驗有意義 的一個稀釋度（即測定劑量反應(yīng)曲線），然后用一個最適稀釋度測定即可。
◆ 收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本，儲存在
4℃?zhèn)溆�，如有特殊原因需要周期收集�?biāo)本，將標(biāo)本及時分裝后放在-20℃或-70℃條 件下保存。避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月。-70度 可保存6個月。部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。
◆ 血清標(biāo)本采集時，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)， 以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。
◆ 為了保證尿液檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須正確收集尿液標(biāo)本和保存。盛尿容器要清潔干燥。 最好使用一次性的容器（如塑料尿杯），避免因用藥并清洗不干凈而造成的污染，影響檢
測結(jié)果。尿液標(biāo)本必須新鮮，留取后，應(yīng)及時檢測或保存，以免細(xì)菌繁殖。因在室溫中久 置后（尤其是夏季）尿中磷酸鹽等可析出結(jié)晶而干擾檢測。
◆ 標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。 保存過久可發(fā)生聚合在ELISA中可使本底加深。
◆ 凍結(jié)標(biāo)本融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛 倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。
◆ 混濁或有沉淀的標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。
◆ 反復(fù)凍融會使蛋白效價降低，所以待測標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。也可 加入適當(dāng)防腐劑。
◆ 如果您在實驗中遇到任何特殊問題，請咨詢我們。
通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的第一步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。
1.血清
血清是最常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。
用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜，使血清析出。（最好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g離心20分鐘，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
采血過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細(xì)胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性。同時也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。
2.血漿
用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃ 1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。
3.細(xì)胞培養(yǎng)上清
取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
4.細(xì)胞裂解液
①吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。
②收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。
③加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。
④將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。
⑤4℃10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5.組織勻漿液
①將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。
②將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分
③將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）
④吸取勻漿液到離心管，4℃ 5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
6.尿液、唾液等其他液體生物樣本
1000×g離心20min，取上清即可檢測。
總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。
為了保證檢測的準(zhǔn)確性，保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1~6個月內(nèi)檢測；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。
另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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