細(xì)胞凍存好了，接下來要注意什么問題呢?沒錯，就是記得到時間了，拿出來復(fù)蘇。那么，細(xì)胞復(fù)蘇的過程中又有哪些該注意的事項(xiàng)呢?細(xì)胞活力和形態(tài)檢查的作用何在?不羅嗦了，請看下文：
活力檢查 – 千萬不要使用不健康的細(xì)胞，可能有污染(真菌、支原體等)，如果發(fā)現(xiàn)有污染毫不猶豫的丟棄!
形態(tài)檢查 – 檢查細(xì)胞的固有形態(tài)和生長行為。
好了，開始切入正題
凍存細(xì)胞：
補(bǔ)充新的培養(yǎng)液 – 在您開始凍存細(xì)胞的前一天補(bǔ)充新的培養(yǎng)液。
在細(xì)胞長至70%單層時收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用凍存液調(diào)整細(xì)胞密度 ~5 x106 cells/ml (根據(jù)不同的細(xì)胞類型調(diào)整)
凍存液 – 用凍存液洗細(xì)胞并用凍存液重懸細(xì)胞，有不同類型的凍存液，根據(jù)細(xì)胞類型選擇最合適的凍存液(常用的凍存液成分有):
– 5-10% DMSO – 注意確保DMSO不含有其他的毒性物質(zhì).
– 5-15% 甘油
– 如果細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)生長，應(yīng)在50%條件培養(yǎng)基內(nèi)(細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基內(nèi)生長24小時)內(nèi)凍存和復(fù)蘇。
在凍存管上標(biāo)記好細(xì)胞類型，日期，凍存人等信息，并保證每凍存管不超過1.5ml.
程序降溫是保證凍存細(xì)胞活性的關(guān)鍵，使用 Mr. Frosty(找生物注一種裝置)保證降溫速度為1°-3°C，置于-80°C冰箱內(nèi)過夜，如果沒有Mr. Frosty裝置，可以使用實(shí)驗(yàn)室常見的泡沫盒、棉花等(原文是實(shí)驗(yàn)室尿布，呵呵，不知道是什么鳥).
放入液氮罐之前記錄凍存管的數(shù)量和位置。以最快的速度轉(zhuǎn)移凍存管知液氮罐內(nèi)，因此，此步驟最好使用干冰，或者把凍存管浸入裝有液氮的小盒內(nèi)。此外還要注意，在凍存管上沒有足夠的空間記錄細(xì)胞的詳細(xì)信息，做好記錄是非常非常重要的!
還有一個最重要的，一定要在異地的液氮罐內(nèi)保存同樣的一份細(xì)胞，以免其中的一個液氮罐出現(xiàn)問題!
細(xì)胞復(fù)蘇-正確的復(fù)蘇方式和正確的凍存方式同樣重要，熟記以下要點(diǎn)：
當(dāng)從液氮罐內(nèi)取出細(xì)胞時，有可能會出現(xiàn)凍存管破裂的情況，使用保護(hù)面罩和防護(hù)服十分必要(找生物注國內(nèi)這個方面做得非常不好吧)
從液氮內(nèi)轉(zhuǎn)移凍存管至熱的(溫度高的)容器內(nèi)，應(yīng)在液氮內(nèi)完成(?)
應(yīng)該與37℃水浴中快速溶解凍存的細(xì)胞，并保證凍存管蓋子在水面之上以避免污染。當(dāng)最小的冰塊溶解后，用70%酒精擦拭凍存管，并迅速轉(zhuǎn)移至新的已經(jīng)預(yù)熱的培養(yǎng)基內(nèi)。
觀察細(xì)胞生長形態(tài)和生長比率。
其實(shí)，細(xì)胞復(fù)蘇只是一個簡單的實(shí)驗(yàn)，不過這其中卻不可避免有一些需要注意的細(xì)節(jié)，不然，也不一定會盡如人意。例如說，人身健康方面：一定要記得做好防凍工作，戴上護(hù)目鏡;盡量降低DMSO對細(xì)胞的損傷等等。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
