閱讀次數:1715 發(fā)布時間:2015/1/12 11:45:03
在微量板ELISA中,根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。下面我們簡單介紹這幾種Elisa實驗的材料準備及操作方法:
1. 間接ELISA
本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下:
(1) 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;
② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清;待檢鴨血清;
③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值,并計算出P/N比值。
(3) 結果判定
已知陽性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知陽性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待檢血清的OD值≥0.4,則判為陽性,否則判為陰性。
2. 雙抗體夾心ELISA
本法主要用于檢測大分子抗原,F(xiàn)以檢測雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
3. 雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于:它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標記每一種抗體,還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為:
① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。
4. 競爭ELISA
此法主要用于測定小分子抗原及半抗原,其原理類似于放射免疫測定。其基本程序為:
① 抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原(對照孔僅加酶標抗原)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
④ 用ELISA檢測儀測定OD值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結合的標記抗原的量就越少,有色產物就減少,這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測;其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記,而且因為抗原的結構不同,還需應用不同的結合方法。此外,試驗中應用酶標抗原的量較多。
5. 阻斷ELISA
本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬。PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序:
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。
本試驗同時設標準陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
6. 抗體捕捉ELISA
本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期,所以檢測出IgM,則可作為某種疾病的早期診斷?贵w捕捉ELISA根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA等幾種,其中以標記抗原捕捉ELISA比較有代表性,該方法的主要程序為:
① 用抗u鏈(抗IgM重鏈)抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
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