一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測實(shí)驗(yàn),必須包含三大要素:性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作,三者缺一不可。在操作過程中,經(jīng)常遇到樣本稀釋問題,需要進(jìn)行樣本稀釋。
一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過程中,超過試劑盒檢測范圍的,樣本值高的可能情況
1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說,比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等,在樣本中本身含量就很高,有的達(dá)到mg/mL濃度。
2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中,大量表達(dá),比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后,大量表達(dá)腫瘤壞死因子α(TNFα),小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后,大量表達(dá)胰島素(INS)。
3、在一些感染性疾病中,大量表達(dá),比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。
4、疫苗原性研究時(shí),注射疫苗的小鼠,會產(chǎn)生大量針對疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品,比如重組蛋白的產(chǎn)物,單克隆抗體純品等。
二.在ELISA檢測過程中,經(jīng)常會遇到這樣的問題:樣本測定OD值超過標(biāo)曲最高點(diǎn)OD值,造成測定數(shù)據(jù)無法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋,如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)? 樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些?
1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí),容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏小。
2、過度稀釋。過度稀釋時(shí),容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏大。
3、稀釋不夠規(guī)范,引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范,特別是大比例稀釋時(shí),人為偏差大大增加。
三、如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)呢?樣本稀釋的原則如下:在查詢背景知識,或者通過預(yù)實(shí)驗(yàn),確認(rèn)了樣本濃度過高,需要進(jìn)行稀釋,就要根據(jù)以下原則,嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。
1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測定的OD值,要求落在標(biāo)準(zhǔn)品最高值OD值的半量程內(nèi),假定標(biāo)準(zhǔn)品最高值的OD值是2.4,那么稀釋后的樣本,OD值接近1.2,在這個(gè)范圍附近,計(jì)算的濃度值最為準(zhǔn)確,以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),得到的樣本濃度最準(zhǔn)確。
2、稀釋過程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋,最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍,就先稀釋10倍,再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上,再進(jìn)行稀釋20倍,得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下,樣本取樣量不要低于5uL,越低的取樣量,在混勻取樣過程中,誤差越大。
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