FCM是利用流式細(xì)胞儀對處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分析技術(shù)。然而，在FCM的實(shí)際應(yīng)用過程中，要想得到高質(zhì)量的流式數(shù)據(jù)卻并非易事。現(xiàn)就FCM實(shí)驗(yàn)中的常見問題進(jìn)行分析，希望能幫助相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員提高實(shí)驗(yàn)成功率。
一、怎么選擇合適的對照？
1）同型對照：使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
2）陰性細(xì)胞對照：使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合。
3）二抗對照：第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗，非特異性結(jié)合一般較高，可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高，設(shè)立二抗對照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
4）陽性對照：一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn)，主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法、試劑、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素。
5）空白對照：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，主要目的是用于測定基礎(chǔ)熒光信號表達(dá)值。
二、收集的細(xì)胞通過流式儀檢測時(shí)，一般多少的細(xì)胞量合適？
進(jìn)行流式檢測時(shí)，至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞，一般調(diào)整細(xì)胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測。
三、FCM檢測過程中如何設(shè)門（gating）？
一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門，即我們通常所說的前散（forward scatter, FSC）和側(cè)散（side scatter, SSC）來設(shè)門。FSC的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān)，不同的細(xì)胞，細(xì)胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)，不同的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，其SSC越大；反之越小。
四、FCM檢測過程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償？
在FCM檢測過程中，如果存在多色，則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)補(bǔ)償首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細(xì)胞。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下，才能既不會(huì)過多又不會(huì)過少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
五、FCM檢測時(shí)，每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎？
FCM檢測時(shí)，若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽性細(xì)胞上的量就會(huì)相對減少。由此可見，不同的細(xì)胞量會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在準(zhǔn)備樣本時(shí)，必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
